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本制品是一种新型、高效的在温和条件下对RNA的3'末端进行生物素(Biotin)标记的试剂盒。使用本试剂盒制备得到的生物素标记的RNA适用于Pull-down、EMSA等RNA-蛋白、RNA-RNA或RNA-DNA相互作用研究，也适用于Northern blot、RNA印迹、原位杂交和miRNA Profiling等实验。

• 组分齐全、性价比高：本试剂盒提供了RNA 3'末端生物素标记所需的试剂，包括pCp-Biotin、T4 RNA Ligase、Reaction Buffer、RNase Inhibitor、Ultrapure Water等，还提供了作为标记对照的Non-labeled RNA Control和Biotinylated RNA Control等试剂。相比采购合成的生物素标记RNA探针，本试剂盒更加经济实用，性价比更高。
  
• 无放射性、标记灵活：本试剂盒可无放射性地高效标记各种RNA 3'端的羟基，常用于标记长度在10～500nt长度范围内的合成或体外转录的RNA。
  
• 标记速度快、标记效率高：通常情况下，本试剂盒进行标记反应仅需将50pmol RNA和20倍摩尔数的pCp-Biotin在25℃反应2小时即可；对一些具有较弱二级结构的RNA探针，只需在37℃反应30分钟；对于二级结构较强或结构复杂的RNA探针则需适当延长反应时间。经检测，本试剂盒的标记效率高达70%以上，用户可通过优化RNA与pCp-Biotin的比例，或在标记反应中加入DMSO使RNA二级结构变弱等，以进一步提高标记效率。

本试剂盒的基本原理如图1所示。本试剂盒提供的Biotinylated Cytidine (Bis)phosphate，简称pCp-Biotin，即Biotinylated Cytidine 3',5'-Bisphosphate (生物素化胞苷3',5'-二磷酸)，其结构的独特之处在于核糖环5'处的磷酸基团(5'-P)，可在T4 RNA连接酶(T4 RNA Ligase)的作用下与RNA 3'末端的羟基(-OH)偶联，同时其3'处的磷酸基团(3'-P)上有一个生物素可用于后续检测。已标记的RNA经氯仿/异戊醇混合物抽提、异丙醇沉淀后，可有效地去除反应副产物。

• 本试剂盒提供的所有试剂都是RNase-free，操作时应小心，避免被污染。所有自行准备的试剂和耗材也都应是RNase-free。如果耗材可能有RNase污染，可考虑用0.01%的DEPC水浸泡过夜，然后高温高压灭菌并烘干。操作时应避免对着样品或所使用的试剂盒耗材呼气或说话，以防RNase污染。建议戴一次性口罩操作。
  
• 对于操作环境中RNA酶的去除，推荐使用核酸酶喷雾清除剂、核酸酶/DNA喷雾清除剂或核酸酶/RNA/DNA喷雾清除剂以去除实验桌面上或其它接触面上的RNase。
  
• 需确保待标记的RNA链的3'末端为羟基。

• 需自备的试剂、耗材和仪器：
  
  • 1-50pmol的待标记RNA (RNA for Labeling)；
    
  • 氯化钠溶液(5M，无菌无酶)、氯仿-异戊醇(24:1)、预冷的异丙醇和70%乙醇、DMSO(如需)。
    
  • PCR仪、水浴或干式恒温器；
    
  • 涡旋混匀仪；
    
  • PCR管(YTC4162/YTC4163)、尼龙膜(YTB4681)。
• RNA 3'末端生物素标记反应：
  
  • 将试剂盒中除PEG8000 Solution (RNase-free)外的所有试剂置于冰上解冻；PEG8000 Solution (RNase-free)在37℃水浴加热5～10分钟，直至呈液体状态。
    
  • 将PCR仪或干式恒温金属浴设定为85℃。
    
  • 取5μL的阳性对照Non-labeled RNA Control (10μM)或5μL待标记RNA (RNA for Labeling)分别加入PCR管中，使用PCR仪或干式恒温金属浴85℃加热3～5分钟后立即置于冰上待用。
    
    • 加热可以打开RNA的二级结构；结构复杂的RNA可先加入约10～25%的DMSO再加热以提高打开RNA二级结构的效率。在RNA探针设计的时候，如果可能宜尽量选择二级结构较弱的RNA序列。
  • 设置RNA 3'末端生物素标记反应体系，参照下表依次添加试剂，用移液器轻轻吹打混匀。
    

    成分	用量(μL)	终浓度(Amount)
    超纯水	4	-
    10×Reaction Buffer	3	1×
    ATP (10mM)	3	1mM (30nmol)
    RNase Inhibitor (40U/μL)	1	1.33U/μL(40U)
    Non-labeled RNA Control or RNA for Labeling (10μM)	5	1.67μM (50pmol)
    pCp-Biotin (1mM)	1	33.3μM(1nmol)
    T4 RNA Ligase (10U/μL)	4	1.33U/μL(40U)
    PEG8000 Solution (RNase-free)	9	-
    Total Volume	30	-

    
    
    • 请按照上表的顺序将试剂依次添加到PCR管中，取不同的试剂或不同管添加试剂时都应更换新的吸头以避免交叉污染。
  • 25℃孵育2小时。
    
    • 待标记RNA反应体系可过夜孵育以提升标记效率，例如16℃孵育16小时。
• T4 RNA Ligase的去除：
  
  • 孵育结束后，取出PCR管，每管加入70μL的Ultrapure Water。
    
  • 每管加入100μL的氯仿-异戊醇(24:1)，剧烈Vortex混匀。然后12000×g离心2～3分钟以分层，小心地转移上层水相(约90μL)至新的1.5mL管中，上清即为3'末端生物素标记的RNA，可用于RNA-蛋白沉淀试剂盒、化学发光法RNA EMSA试剂盒等下游实验。
    
    • 本试剂盒针对50pmol用量的RNA进行了优化，1-50pmol的RNA通常具有相近的标记效率。RNA的纯度越高二级结构越弱，通常标记效率越高。具体的待标记RNA最佳标记浓度请自行通过实验进行摸索和优化。
• 3'末端生物素标记RNA的异丙醇沉淀(选做)：很多情况下，上述标记的RNA可直接使用。但有些时候，经异丙醇沉淀后的RNA的纯度会进一步提高，并可以改善后续实验的效果。如需进行异丙醇沉淀，可按照如下步骤操作。
  
  • 对于上述每管标记好的RNA (约90μL)，加入10μL5M的NaCl和1μL Glycogen (20mg/mL)，再加入0.6-1体积预冷的异丙醇，混匀。
    
  • -80℃放置1小时，或-20℃放置过夜。
    
  • 4℃，12000×g离心30分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。
    
  • 加入300μL预冷的70%乙醇，4℃，12000×g离心10分钟。小心去除上清，切不可触及沉淀。
    
  • 4℃，12000×g离心1分钟，小心吸去残余液体。微晾干沉淀，但不宜过分干燥。
    
  • 加入20μL Ultrapure Water，完全溶解沉淀。标记好的RNA可以-20℃保存。
• RNA 3'末端生物素标记效率的检测：
  
  • 取1μL的Biotinylated RNA Control (1μM)，加入9μL Ultrapure Water，混匀，稀释成100nM Biotinylated RNA Control (作为标准品)，取出适量100nM Biotinylated RNA Control，依次稀释成80nM、60nM、50nM、40nM、30nM (可以参考图2)。
    
  • 取2μL步骤3b所获得的生物素标记RNA样品(约500nM)，加入8μL Ultrapure Water，混匀，稀释成100nM生物素标记RNA样品(作为待测样品)。取出适量100nM生物素标记RNA样品，依次稀释成80nM、60nM、50nM、40nM、30nM。
    
  • 参考下面的表格，取一适当大小的带正电荷尼龙膜，在膜上做好相应标记。对于经过梯度稀释的标准品和待测样品，分别取1μL滴加到膜上。在膜上滴加标准品或待测样品时，请注意使液滴充分被膜吸收，在膜上形成一个湿的圆形小斑点。
    说明：如果条件许可，可以使用专门用于点杂交或狭缝杂交的设备进行探针标记效率的检测，探针的用量参考下表。浓度可以稀释50倍，而此时所用体积需要相应放大50倍至100μL。
    

    Concentration	100nM	80nM	60nM	50nM	40nM	30nM
    Biotinylated RNA Control	2μL	2μL	2μL	2μL	2μL	2μL
    Biotinylated RNA Sample	2μL	2μL	2μL	2μL	2μL	2μL

    
    
  • 滴加完所有的标准品和样品后，将膜室温晾干。
    
  • 用紫外交联仪选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联30～45秒。如果没有紫外交联仪，也可以使用超净工作台内的紫外灯或手提式紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射1～10分钟。最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索。
    
  • 随后可以立即采用各种生物素检测试剂盒，检测出样品的生物素标记效率；也可以室温存放数天直至进行后续检测。推荐使用生物素标记核酸检测试剂盒(化学发光法)。
    
  • 如果最后采用的是ECL类试剂或其它类似试剂进行检测，则可以对比待测样品和标准品的灰度，从而计算出标记效率。标记效率也可以通过建立标准曲线进行比较精确的计算。
    
    • 本试剂盒提供的Non-labeled RNA Control的标记效率通常大于70% (请参考图2)。标记效率取决于RNA的长度和结构复杂度，对标记效率较低的RNA可通过优化RNA和pCp-Biotin的比例、选择二级结构较弱的RNA序列等以提高标记效率。